Isolierung, neurotrophes Potenzial und Transfer-Eignung von olfaktorischen "Ensheathing"-Zellen als Voraussetzung für den Einsatz zur neuronalen Regeneration nach Rückenmarktraumata

Status:

abgeschlossen 06/2019

Zielsetzung:

Eine Strategie zur Behandlung von traumatischen Rückenmarksläsionen könnte eine autologe Zelltherapie sein. Dabei stellt die olfaktorische Mukosa (OM) eine attraktive Zellquelle dar. Die neuroregenerativen Eigenschaften olfaktorischer multipotenter Stammzellen (OSC) und olfaktorischer Ensheathing-Zellen (OEC) wurden erfolgreich in Tiermodellen gezeigt. Neueste Studien zeigen, dass auch in der respiratorischen Mukosa (RM) Zellen mit neuroregenerativen Eigenschaften vorzufinden sind, die sogenannten Inferior turbinate stem cells (ITSC). Bislang gibt es allerdings keine standardisierten Methoden zur Zellisolierung und Charakterisierung, was eine Grundvoraussetzung für den therapeutischen Einsatz darstellt und für die Qualität und Sicherheit essenziell ist. Ziel dieser Arbeit war es, die OEC zu isolieren und nach anschließender Aufreinigung diese zu charakterisieren sowie deren Funktionalität zu bestimmen. Zudem wurde das Verhalten der aufgereinigten Zellen in einer Plasma-Clot-Matrix aus koaguliertem Blutplasma untersucht, welche als Trägermatrix für die Zellen bei einer möglichen Transplantation dienen kann.

Aktivitäten/Methoden:

Durch den Einsatz enzymatischer und mechanischer Methoden konnten Zellen sowohl aus der olfaktorischen Epithelzellschicht als auch aus der Lamina Propria (LP) erfolgreich isoliert, kultiviert und expandiert werden. Des Weiteren war eine Isolierung von Zellen aus der LP der respiratorischen Mukosa, den sogenannten ITSC, möglich, wobei diese Zellen eine stärkere und schnellere Proliferation als die olfaktorischen Zellen aufwiesen, die durch verschiedene Stimuli beeinflusst werden konnte. Zelluläre und funktionelle Unterschiede zwischen respiratorischer und olfaktorischer Mukosa zeigten sich sehr deutlich. Aus der ET der RM konnten beispielsweise keine vitalen, adhärenten Zellen isoliert werden. Lediglich in der LP der OM konnten p75 (OEC-Marker) positive Zellen in jungen Passagen detektiert werden. Jedoch zeigten sowohl olfaktorische als auch respiratorische Zellen aus der Lamina propria CD90 (Stammzellmarker) positive Zellen, deren prozentueller Anteil mit zunehmender Passagenanzahl zunahm.

Die Reinheit bzw. die mögliche Kontamination mit Mukus-produzierenden Zellen wurde durch Analyse der Expression des Mucins MUC5AC, sowie CD90, Nestin, p75NTR und EpCAM untersucht. Mucin-positive Zellen konnten direkt nach der Isolierung sowohl in den Zellfraktionen der Epithelzellschicht als auch der Lamina propria der OM nachgewiesen werden. Im Zuge der Kultivierung und Passagierung der Zellen gingen diese allerdings verloren.

Ergebnisse:

Durch die Durchführung des Neurosphären-Assay war es möglich, OSC aus der Epithelzellschicht der OM aufzureinigen. Diese waren Nestin- und CD90-positiv und konnten im Vergleich zu Knochenmarkstammzellen nicht in Zellen der mesenchymalen Richtung differenzieren (osteogene und adipogene Differenzierung). Allerdings zeigten diese aufgereinigten Stammzellen in neuronalem Differenzierungsmedium eine Neuronen-ähnliche Morphologie, wobei diese Zellen positive für den neuronalen Marker ß-III Tubulin waren. Die frisch isolierte Zellfraktion aus der LP der OM zeigte sowohl p75NTR-positive OEC als auch CD90-positive mesenchymale Stammzellen. Der Anteil der p75NTR-positiven Zellen nahm allerdings im Zuge von weiteren Passagen ab. Durch eine immunomagnetische Aufreinigung konnte eine Anreicherung von p75NTR positiven/ CD90-negativen Zellen OEC werden. Die funktionelle Charakterisierung der aufgereinigten OEC-Fraktion ergab, dass einige Zellen in der Lage waren zu phagozytieren, was ein typisches Charakteristikum von OEC darstellt. Eine Analyse der Zellkulturüberstände von olfaktorischen Ensheathing Zell-Fraktionen mithilfe eines Human Growth Factor Antibody Arrays ergab keine verstärkte Freisetzung neurotropher Faktoren, wie NGF, BDNF oder NT-4/5 im Vergleich zum reinen Zellkulturmedium. Jedoch zeigte sich eine verstärkte Expression von Insulin-like growth factor bindenden Proteinen in diesen Zellkultur-überständen. Diese konditionierten Zellkulturüberstände führten bei neuronalen embryonalen Stammzellen zu einer Veränderung der Morphologie, wobei diese Zellen eine Neuronen-ähnliche Morphologie aufwiesen und langgestreckte Zellfortsätze aufwiesen. Bei einer möglichen Zelltherapie stellt der autologe Plasma-Clot eine geeignete Zellträgermatrix dar. Die Analyse des Verhaltens der isolierten und aufgereinigten Zellen in solch einer Matrix zeigte, dass diese vital waren, proliferierten und dreidimensional angeordnet waren. Physiologisch würde sich eine solche Matrix nach einer bestimmten Zeit auflösen, wobei die Degradation der Plasma-Clot Matrix in vitro nach sieben Tagen beobachtet werden konnte.

Zusammenfassend konnten sowohl OEC als auch OSC und ITSC erfolgreich isoliert, aufgereinigt und charakterisiert werden. Es zeigte sich allerdings, dass eine reine OEC Zellfraktion mit einer hohen Zellausbeute nicht gewonnen werden konnte. Mukus- produzierende Zellen und Epithelzellen gingen durch die Kultivierung der Zellen allerdings verloren. Die Isolierung und Charakterisierung der OSC war hingegen sehr erfolgreich.

Stand: